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納米氫氧化鎂對茶葉黑斑病原真菌活性的抑制效果

添加時間:2018-08-05 10:39 來源:未知 作者:代寫 論文網
  摘要:茶葉真菌病害是引起茶葉減產的重要原因之一, 納米材料作為環境友好型抗菌材料可應用于抑制茶葉真菌病害。本研究通過共沉淀法合成納米氫氧化鎂 (nano-Mg (OH) 2) , 研究其抑制茶葉黑斑病原真菌的效果。采用X-射線粉末衍 (X-ray powder diffraction, XRD) 表征nano-Mg (OH) 2的尺寸, 通過謝樂公式計算得出合成的納米顆粒在 (101) 面的尺寸為14.5 nm.利用掃描電鏡 (scanning electron microscope, SEM) 對nano-Mg (OH) 2的形貌進行觀察, 發現納米顆粒結構呈規則的片狀。對茶葉黑斑病原真菌進行分離純化, 通過形態學觀測、核糖體DNA內轉錄間區 (internal transcribed spacer, ITS) 序列分析、ITS區特異性引物PCR檢測和系統發育關系比較, 確定分離的病原菌為芒果球座菌 (Guignardia mangiferae) , 茶葉上此類真菌的報道較少。采用平板涂布的方法, 以空白對照和陽性對照 (堿性條件) 為對照組, 以不同濃度nano-Mg (OH) 2為實驗組, 經培養一段時間后通過十字交叉法測量真菌生長直徑并計算抑制率。結果表明, nano-Mg (OH) 2能有效的抑制茶葉真菌的生長, 5 mg/mL nano-Mg (OH) 2在3 d時對菌絲生長抑制率可達48.78%, 隨著濃度增加效果更為顯著, 50 mg/mL nano-Mg (OH) 2對菌絲生長有100%的抑制率, 半最大效應濃度 (half maximal effective concentration, EC50) 為7.63 mg/mL.研究結果可為后續研發安全、有效的納米制劑提供科學依據和技術支持。
  
  關鍵詞:納米氫氧化鎂; 茶葉黑斑病; 抑制真菌;
 
  
  茶樹 (Camellia sinensis) 是一種山茶科的灌木植物, 是我國的重要經濟作物。茶葉真菌病害較為普遍, 受真菌侵染造成產量下降、質量不佳。已有報道茶葉病害有30多種, 其中最常見有茶白星病、茶炭疽病、茶圓赤星病、茶云紋葉枯病等 (葉麗娟, 2006;趙曉珍, 2017) .此外, 對于芒果球座菌 (Guignardia mangiferae) 引起植物病害, 近年來報道的有番石榴 (Psidium guajava) 黑斑病、香蕉 (Citrus reticulata) 黑斑病、柑橘 (Musa paradisiaca) 黑斑病等, 當前對茶葉黑斑病少有報道 (孫嘉曼等, 2016) .目前防治茶葉真菌病害的藥劑以化學藥劑為主, 化學藥劑的施用對環境的負面影響較大, 且容易在茶葉上造成農藥殘留, 不利于控制藥殘和生態茶園的建設 (尤志明等, 2017) .因而如何制定茶園病害綠色防控技術是當前中國茶葉產業實現持續、穩定和健康的國際化發展戰略的關鍵。隨著科技的進步, 納米材料可以作為新型的殺菌劑和殺蟲劑, 已逐漸應用在植物保護領域。納米材料具有表面和界面效應、量子尺寸效應、小尺寸效應和宏觀效應等超常特性, 在在農業不同領域都有廣泛的應用 (Iavicoli et al., 2017;Kim et al., 2018) .與傳統無機抗菌劑相比, 納米殺菌劑更具優良的抗菌效果。
  
  本研究從茶葉危害狀部位分離病菌, 經形態特征與分子鑒定結果, 確定分離的菌株為黑斑病菌。采用共沉淀法制備納米氫氧化鎂 (nano-Mg (OH) 2) , 利用X-射線粉末衍射 (X-ray powder diffraction, XRD) 和掃描電鏡 (scanning electron microscope, SEM) 對制備的nano-Mg (OH) 2的尺寸和形貌進行表征, 研究Mg (OH) 2對黑斑病菌的抑制作用, 以期為納米制劑防治茶葉真菌病害提供科學理論依據。
  
  1 材料與方法
  
  1.1 材料
  
  1.1.1 病葉樣品
  
  于2018年10月從福建農林大學茶園采集茶樹 (Camellia sinensis) 病葉。
  
  1.1.2 培養基
  
  PDA固體培養基:煮沸成泥馬鈴薯200 g, 紗布過濾后加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂, 定容至1 000mL, 高壓蒸汽滅菌 (于麗波等, 2016) .
  
  1.2 方法
  
  1.2.1 茶葉病原真菌的分離培養和保存
  
  采取病葉, 選取帶有圓形稍凹陷的黑色病斑黑色小點零散于病斑的葉片, 病斑邊緣呈黃褐色暈圈。消毒清洗葉片表面后, 于病健交界處剪取大小5 mm×2 mm的葉片, 酒精浸泡1~2 s, 5%次氯酸鈉溶液浸泡5 min, 漂洗3次 (趙曉珍, 2017) .將處理過的葉片組織以三角形排列方式置于培養皿, 24~28℃培養, 待長滿菌絲。邊緣處打孔置于培養皿中央, 培養一周左右后于4℃保存備用。
  
  1.2.2 病原菌的形態特征
  
  采用接菌針將黑斑病原菌絲劃線于PDA培養基上, 產孢后挑取病原菌經制片、壓片, 在光學顯微鏡下對黑斑病菌的菌落的大小、顏色、形態等記錄分析, 根據《真菌鑒定手冊》 (魏景超編著, 上海科學技術出版社, 1979) 進行初步鑒定。
  
  1.2.3 病原菌的分子水平鑒定
  
  通過十六烷基三甲基溴化胺 (cetyl-trimehtylammonium bromide, CTAB) 法提取DNA, 刮取適量菌絲加入0.2 g石英砂和100μL CTAB, 65℃水浴加熱1 h.加入1∶1體積的氯仿∶異戊醇, 離心后提取上清加入等體積的氯仿∶異戊醇, 重復操作。取上清加入2/3上清液體積的異戊醇 (-20℃) , -20℃下靜置過夜。離心棄上清, 70%乙醇 (-20℃預冷) 清洗, 待乙醇蒸發后加入60μL ddH2O, 溶解后置于-20℃下備用 (羅金水等, 2018) .
  
  核糖體DNA內轉錄間隔區 (internal transcribed spacer, ITS) 序列可用于對真菌菌株的種屬進行分類鑒定, 是探究植物種間關系的有效手段。因此, 利用引物ITS對病原菌株的基因組DNA進行PCR擴增。 (羅金水等, 2018;王興紅, 2012) , 反應體系 (25μL) :ddH2O 9.5μL;ITS4 (0.96 nmol/μL) 1μL, ITS5 (1.40 nmol/μL) 1μL;Taq DNA聚合酶mix12.5μL;DNA模板1μL.反應程序:95℃預變性10 min;95℃變性15 s, 52℃退火30 s, 72℃延伸15s, 35次循環;最后72℃延伸7 min.取2.5μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物送至福州鉑尚生物技術有限公司公司測序。所得測序結果在GenBank數據庫進行BLAST序列比對, 確定屬、種相似的菌株序列, 用鄰接法構建系統進化樹。
  
  1.2.4 納米氫氧化鎂合成和表征
  
  利用MgCl2·6H2O和NaOH作用生成沉淀來合成nano-Mg (OH) 2.7 g MgCl2·6H2O加10 mL ddH2O攪拌溶解;2.76 g NaOH加10 mL ddH2O攪拌溶解。將NaOH溶液均勻滴入MgCl2·6H2O溶液中, 攪拌過夜。以10 000 r/min離心5 min后取沉淀, 洗滌3次, 離心, 干燥研磨。使用XRD和SEM對nano-Mg (OH) 2尺寸和形貌進行觀察和分析, 通過謝樂 (Scherrer) 公式計算得出合成的納米顆粒的尺寸。
  
  1.2.5 納米氫氧化鎂抑制真菌實驗
  
  采用平板涂布的方法進行抗真菌實驗。分別配制5、25和50 mg/mL的nano-Mg (OH) 2水溶液, 并用超聲清洗儀超聲40 min, 備用。在PDA培養基中央注上100μL nano-Mg (OH) 2水溶液, 涂布均勻, 晾干后在平板中部接上真菌。以不加任何物質的PDA平板作為空白對照, 以pH=11的NaOH作為陽性對照, 各濃度的nano-Mg (OH) 2溶液為實驗組, 進行重復實驗。將培養皿倒置于26℃恒溫箱繼續培養3~7 d后, 以十字交叉法測量真菌的直徑 (鐘靈珅, 2018) , 觀察真菌的生長情況。此外, 根據公式I=[ (C-E) /C]×100%計算抑制率, 其中I為nano-Mg (OH) 2對黑斑病菌的抑制率 (%) , C和E分別為空白組菌落直徑和實驗組菌落直徑 (cm) .記錄數據并計算出EC50.
  
  2 結果與分析
  
  2.1 納米氫氧化鎂的表征
  
  采用XRD對nano-Mg (OH) 2的尺寸進行計算, 并利用SEM對其形貌進行觀察。結果表明, 通過共沉淀法合成的Mg (OH) 2與標準數據庫卡片 (J國際衍射數據中心ICDD, http://www.ccrs.net.cn/ICDD/, PDF-2數據庫, No.044-1482) 的特征峰完全吻合, 通過謝樂公式得出nano-Mg (OH) 2在 (101) 面的尺寸約為14.5 nm (圖1A) , 且合成的nano-Mg (OH) 2呈較為規則的片狀結構, 有一定的團聚行為 (圖1B) .
  
  圖1 納米Mg (OH) 2的XRD分析 (A) 和SEM成像 (B)

  
  圖2 病原菌的培養特征

  
  2.2 病菌株的鑒定
  
  2.2.1 病原菌的形態學特征
  
  分離的病原菌 (菌株編號:FAFU20181029) 在PDA培養基上菌絲初為灰白色, 經一段時間后菌絲致密, 菌絲絮狀平鋪生長, 菌落呈黑橄欖色, 表面帶有黑色小粒子, 菌落邊緣呈橄欖色, 邊緣凹陷且平整, 背面呈黑色 (圖2A) .在顯微鏡下觀察分生孢子, 未成熟孢子由端部向基部變窄, 成熟孢子為單胞, 呈圓形, 無色透明 (圖2B, 2C) .
  
  2.2.2 病原菌的分子生物鑒定
  
  采用CTAB法提取DNA, 以引物ITS對黑斑病菌株的基因組進行PCR擴增, 隨后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的黑斑病菌DNA.凝膠電泳圖中目的條帶單一且清晰 (圖3) , 表明菌株DNA提取成功。所送測序的PCR產物的測序結果在GenBank數據庫進行BLAST序列比對, 選擇與數據庫中屬、種相識度較高的菌株序列, 確定菌株屬、種, 用鄰接法構建系統進化樹, 結果表明該菌株在進化樹上歸屬于芒果球座菌 (圖4) .
  
  圖3 基因組DNA電泳圖
  
  
  圖4 基于ITS序列分析得到的NJ-系統樹

  
  2.3 納米氫氧化鎂對茶葉黑斑病原菌的抑制作用
  
  用5、25和50 mg/mL的nano-Mg (OH) 2溶液均勻涂布在PDA培養基上, 將黑斑病菌接在培養基中部。觀察發現, nano-Mg (OH) 2對黑斑病菌的生長具有較高的抑制作用, 與空白組相比, 在含nanoMg (OH) 2PDA平板上生長的黑斑病菌生長直徑明顯減少, 且隨著nano-Mg (OH) 2濃度的增加, 黑斑病菌生長的直徑也隨著減少, 菌落與培養基的緊貼程度變小, 出現透明圈 (圖5) .經計算, 3 d時5 mg/mL nano-Mg (OH) 2對菌絲生長抑制率可達48.78%, 50 mg/mL的nano-Mg (OH) 2對菌絲的抑制率為100% (表1) , 且EC50為7.63 mg/mL.此外, 由于nano-Mg (OH) 2呈堿性, 為了進一步驗證堿性對黑斑病菌生長抑制是否有影響, 因而設置了堿性條件 (pH=11的NaOH溶液) 為陽性對照, 涂布平板后接上真菌。結果表明, 堿性條件下與空白對照的黑斑病菌生長差異小, 說明堿性對黑斑病菌生長沒有明顯的影響, 是nano-Mg (OH) 2自身對黑斑病原菌有很強的抑制作用。
  
  圖5 黑斑病原菌分別與不同濃度的納米氫氧化鎂作用3~7 d后的平板圖

  
  表1 nano-Mg (OH) 2對黑斑病原菌的抑菌率

  
  3 討論
  
  當前隨著高效、選擇性強的殺菌劑被廣泛得應用, 植物病原菌對殺菌劑的抗藥性越來越嚴重。相對于有機、天然類抗菌劑而言, 無機納米材料具有抗菌性、毒性低, 對環境生態和人類健康的危害小, 且具有耐熱性以及病原菌不容易產生抗性等優點 (饒文華等, 2018) .因此, 納米材料可以作為環境友好型的抗菌劑。已有研究表明, 納米SiO2對小麥 (Triticum aestivum) 白粉病具有很好的抑制效果, 抑制率高于80% (王荔軍等, 2001) .而光降解性型的納米TiO2對煙草青枯菌 (Pseudomonas solanacearum) 的抑制率可達90% (蒲麗等, 2005) , 且TiO2溶膠材料具有廣譜、高效的抗植物病原菌的能力, 在12 h對黃瓜 (Cucumis sativus) 細菌性角斑病菌、番茄 (Lycopersicon esculentum) 瘡癡病菌、禾谷巨大芽胞桿菌 (Bacillus megaterium pv.cerealis) 、茄假單胞菌 (pseudomonas solanacearum) 和水稻白葉枯菌 (Xanthomonas oryzae pv.oryzae) 的抗菌率均達到100% (李玲玲, 2007) .
  
  然而, 由于納米材料本身對生物體具有一定的毒性 (Sharifi et al., 2012) , 因而在選擇納米材料作為抗真菌制劑時, 應該重點關注其環境安全性。nano-Mg (OH) 2作為安全、對環境無污染的綠色安全水處理劑, 對人體細胞和生物體均無明顯的毒性 (Zhang et al., 2014;李春輝, 2013) , 在環境和實際生活中已被廣泛地應用 (林璋等, 2014) .此外, 與其他納米材料相比, nano-Mg (OH) 2的來源簡單且成本低, 因而可以作為綠色環保低成本的納米抗菌劑。
  
  從茶葉危害狀分離得到的病原菌, 經形態觀察和分子鑒定, 為黑斑病原菌:芒果球座菌。芒果球座菌引起的黑斑病出現在茶葉葉片上, 病斑逐漸擴大嚴重影響茶葉品質和經濟價值 (張慧麗等, 2011) .本研究用MgCl2·6H2O和NaOH共沉淀法合成nano-Mg (OH) 2, 研究其對茶葉黑斑病菌的抑制作用。結果表明, nano-Mg (OH) 2的濃度與抑制率呈正相關, 濃度越高抑制率越大。而前期的研究也證實納米材料的抗菌效果主要取決于材料的形貌、濃度、表面電荷等理化性質。在納米材料抗菌機理上, 一般認為有活性氧 (reactive oxygen species ROS) 抗菌機理、金屬離子溶出抗菌機理和接觸型滅菌機理三種, 而nano-Mg (OH) 2對茶葉黑斑病原菌的抗菌機理還有待進一步的深入研究。本研究可為今后將nano-Mg (OH) 2應用于茶葉病原菌的防治提供理論基礎和技術支持。
  
  4 結論
  
  本研究采用nano-Mg (OH) 2對茶葉黑斑病原真菌的抑制作用。采用XRD和SEM對所合成的nano-Mg (OH) 2的尺寸和形貌進行表征, 對茶葉危害狀分離得到的病原菌進行分子生物學鑒定。結果表明, 分離得到的茶葉病原菌為芒果球座菌, nanoMg (OH) 2對其具有很強的抑制作用, 且nano-Mg (OH) 2的濃度越高抑制效果越好, 且nano-Mg (OH) 2對病原菌的抑制作用并非其堿性導致, 而是自身的抑制效應。
  
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